细胞の计数系列【1】全血中PBMC细胞的提取分离与检测-深圳市亨睿生物科技有限公司

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细胞の计数系列【1】全血中PBMC细胞的提取分离与检测

内容

什么是PBMC?

PBMC细胞为外周血单个核细胞，其主要的细胞类型为血液中具有单个核的细胞，其分类为淋巴细胞、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞以及其他少量的细胞类型，分离PBMC的意义在于为了将多核细胞和红细胞去除，从而更好的去模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll密度梯度离心法原理

一般使用Ficoll密度梯度离心法获取PBMC，Ficoll 是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量 400,000，当密度为 1.2 g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

Ficoll密度梯度离心法操作步骤

操作步骤

1. 利用PBS对于全血进行稀释；

2. 像离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll；

3. 把稀释好的血液加入淋巴细胞分离液Ficoll上，后进行离心；

4. 离心后管内分为3层；如图1所示；上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。

在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

5.去除上层液体，吸取云雾层，加入5倍体积的PBS，洗涤细胞两次；

6.末次离心后，加入培养基重悬，进行细胞计数

图1

注意事项

1. 利用PBS稀释全血，将稀释后的全血加入Ficoll液时动作要缓慢，注意要保持清楚的界面，全血：PBS：Ficoll液=1:1:1

2. 吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。

人PBMC中不同细胞的比例

人PBMC细胞	比例
单核细胞	10%-30%
淋巴细胞	70%-90%
T细胞总数（CD3+）	占淋巴细胞的45%-70%
CD4+ T细胞数	占T细胞总数的25%-60%
CD8+ T细胞数	占T细胞总数的5%-30%
B淋巴细胞	5%-15%
NK细胞	5%-10%
树突状细胞(DC)	1%-2%
干细胞	0.1%-0.2%

PBMC细胞检测

细胞检测

全血样本经细胞提取分离后用于下游实验时，精准的细胞计数是至关重要的一步。因此对于样本中总的有核细胞以及活细胞都要进行精准计数。虽然台盼蓝染色法是常用的活细胞计数方法，但是对于含有红细胞、血小板和杂质的样本，台盼蓝染色法不能区分有核细胞、红细胞以及杂质（图2、图3）。如果要精准计数的话，应该选用双荧光AO/PI细胞计数法，它能保证计数结果的准确性和稳定性（图4）。

图2明场下血液样本图片

图3明场下提取的PBMC图片

图4 AO/PI染色原理

Countstar Rigel智能一体化荧光分析仪以及Countstar Mira FL细胞荧光分析仪是基于图像识别法，配合多荧光通道，通过采集图像中的细胞信息，进行定量分析的智能系统。它将荧光显微成像与统计学群体分析结合于一身，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，两款仪器都可以结合AO(吖啶橙)和PI(碘化丙啶)，可以排除杂质、红细胞以及血小板的干扰，从而得到准确的计数结果（图5、图6）